Caracterização estrutural do anti-ativador de quorum sensing QsrO de Pseudomonas aeruginosa

Behnken, Luiza Carvalho

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11422/8866

Type:	Trabalho de conclusão de graduação
Title:	Caracterização estrutural do anti-ativador de quorum sensing QsrO de Pseudomonas aeruginosa
Author(s)/Inventor(s):	Behnken, Luiza Carvalho
Advisor:	Pinheiro, Anderson de Sá
Abstract:	QsrO (Quorum Sensing Repressive ORF) é um regulador capaz de bloquear a expressão de genes controlados por quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa, levando a diminuição da virulência e patogenicidade desta bactéria. QsrO é uma proteína de 166 aminoácidos que não apresenta similaridade de sequência com nenhuma outra proteína conhecida até o momento. Apesar da função inibitória de QsrO ser bem estabelecida, os mecanismos moleculares através dos quais a proteína atua ainda são pouco entendidos. Neste trabalho, utilizamos uma série de técnicas bioquímicas e biofísicas para caracterizar o estado oligomérico e a conformação de QsrO. A construção His6MBP-QsrO1-166 foi expressa em Escherichia coli BL21(DE3) a temperatura de 18°C, durante 18 h, com a adição de isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo 1 mM. A proteína foi purificada por uma combinação de técnicas cromatográficas: afinidade à amilose, afinidade a níquel e exclusão molecular. A proteína purificada apresentou dois picos de eluição na cromatografia por exclusão molecular, sugerindo a existência de dois estados oligoméricos. Estes estados foram caracterizados como dímero e trímero através de crosslinking e SDS PAGE. As massas moleculares estimadas a partir da exclusão molecular foram maiores do que as esperadas para o dímero e trímero de QsrO, sugerindo que a proteína não adota uma estrutura globular. Ainda, a oligomerização de QsrO ocorre com afinidades subnanomolares. A topologia global de QsrO foi investigada por espalhamento de raios-X a baixo ângulo. A análise de Guinier mostrou um raio de giro (Rg) de 6,49 nm, a análise de Kratky indicou que a proteína não apresenta regiões desenoveladas e a análise da função de pares de distribuição sugeriu que QsrO apresenta um formato alongado. A estrutura secundária de QsrO foi investigada por dicroísmo circular (CD). O espectro de CD mostrou mínimos em 222 e 211 nm, além de um máximo em 195 nm, compatível com uma conformação majoritariamente -helicoidal. A estabilidade de QsrO contra agentes desnaturantes foi investigada por espectroscopia de fluorescência. O espectro de fluorescência intrínseca de QsrO apresentou máximo de emissão em 347 nm, sugerindo que o único resíduo de triptofano presente na proteína encontra-se exposto ao solvente e, portanto, não participa da interface de oligomerização. A adição de concentrações crescentes de ureia promoveu um aumento da intensidade de fluorescência da sonda extrínseca 1,8-ANS, sugerindo a exposição de segmentos hidrofóbicos. Entretanto, mesmo frente a 8 M de ureia, a intensidade de fluorescência do 1,8-ANS permaneceu alta, indicando que a proteína é resistente a desnaturação. Em conjunto, nossos dados sugerem que o anti-ativador QsrO é constituído por um feixe de -hélices alongado, altamente estável, capaz de formar dímeros e trímeros.
Keywords:	Quorum sensing Pseudomonas
Subject CNPq:	CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
Production unit:	Instituto de Química
Publisher:	Universidade Federal do Rio de Janeiro
Issue Date:	2-Jul-2019
Publisher country:	Brasil
Language:	por
Right access:	Acesso Aberto
Appears in Collections:	Química

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