Estudos estruturais e comparativos dos mutantes racionais da lipase Pf2001Δ60 de Pyrococcus furiosus

Gusmão, Bianca Rizo Ventura

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			http://hdl.handle.net/11422/25397

Type:	Trabalho de conclusão de graduação
Title:	Estudos estruturais e comparativos dos mutantes racionais da lipase Pf2001Δ60 de Pyrococcus furiosus
Author(s)/Inventor(s):	Gusmão, Bianca Rizo Ventura
Advisor:	Gutarra, Melissa Limoeiro Estrada
Co-advisor:	Ano Bom, Cristiane Dinis
Co-advisor:	Andrade, Rafael Alves de
Abstract:	Lipases são enzimas capazes de atuar em diferentes meios de reação e normalmente apresentam elevada régio e/ou esteroespecificidade. Devido a sua alta versatilidade frente aos meios reacionais e especificidade a substratos, as lipases são utilizadas como biocatalisadores em diversos setores industriais, entre eles, o setor do biodiesel. Entretanto, a utilização de enzimas neste setor ainda é restrita devido ao alto custo e condições específicas de reação, limitando sua utilização como biocatalisadores. A utilização de enzimas de microrganismos hipertermófilos em bioprocessos é uma possibilidade real, já que essas lipases são resistentes à grande parte das condições requeridas nos bioprocessos. A lipase Pf2001Δ60 da arquea hipertermofílica Pyrococcus furiosus apresenta alta termoestabilidade e termoatividade, características desejáveis para a produção de biodiesel e que justificam o seu grande potencial biotecnológico. Entretanto, essa enzima não apresenta afinidade por ácidos graxos de cadeia longa, propriedade essencial na indústria de biodiesel. Logo, estudos destinados ao melhoramento da lipase Pf2001Δ60 para fins de aplicabilidade industrial são de extrema importância. Através da estrutura cristalográfica e simulação de dinâmica molecular, uma região com características flexíveis foi identificada como um subdomínio tampa, que pode proteger ou expor o sítio ativo da lipase dependendo da conformação da proteína o que pode afetar a entrada do substrato. Nesse contexto, três mutantes racionais foram construídos com mutações específicas no subdomínio em tampa da lipase Pf2001Δ60: W194A, F198A e W194A/F198A com o propósito de avaliar possíveis mudanças nas características bioquímicas da enzima. Este trabalho tem como objetivo comparar a lipase Pf2001Δ60 selvagem com mutantes racionais W194A, F198A e W194A/F198A a fim de obter um biocatalisador otimizado para a produção de biodiesel. As mutações foram cedidas pelo colaborador David Reverter da Universidat Autonoma de Barcelona. As transformações e os testes de expressão foram realizados em diferentes condições visando definir um protocolo ideal para a produção das lipases selvagem e mutantes. O extrato bruto da lipase selvagem e dos mutantes foram purificados através das técnicas de cromatografia de afinidade e gel filtração e as frações obtidas foram monitoradas através de SDS-PAGE. Somente a purificação da lipase selvagem e o mutante W194A atingiram um alto grau de pureza e assim, apenas a lipase selvagem e o mutante W194A foram utilizadas para os ensaios de termoestabilidade e especificidade à diferentes substratos. Estudos anteriores revelaram que a enzima selvagem apresenta especificidade para ésteres de cadeia média com temperatura ótima a 80°C. Assim, as atividades da lipase Pf2001Δ60 selvagem e da mutante W194A foram medidas na presença de substratos de diversos tamanhos de cadeia carbônica. As lipases apresentaram maior atividade na presença de substratos de cadeia média (C8). Entretanto, a lipase mutante W194A apresentou maior atividade para susbtratos de cadeia longa (C16), um dado importante para a possível aplicação da enzima na produção de biodiesel. Os ensaios de termoestabilidade das lipases Pf2001Δ60 e W194A indicaram comportamento semelhante para ambas enzimas, com manutenção de sua atividade até a temperatura de 70°C e perda acentuada da atividade a 90°C. Contudo, a enzima mutante mostrou maior atividade a 90°C do que a enzima selvagem, indicando que a mutação W194A aumenta sua termoestabilidade. Os dados obtidos reforçam a importância dos estudos estruturais mostrando que mutações racionais podem levar ao melhoramento de enzimas para aplicação biotecnológica.
Keywords:	Lipases Biodiesel Biocatalisadores
Subject CNPq:	CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA::TECNOLOGIA QUIMICA
Production unit:	Escola de Química
Publisher:	Universidade Federal do Rio de Janeiro
Issue Date:	Jan-2017
Publisher country:	Brasil
Language:	por
Right access:	Acesso Aberto
Appears in Collections:	Engenharia Química

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